Городская Сочинская Централизованная Лаборатория

ПЦР — это метод лабораторной диагностики, направленный на выявление возбудителей инфекционных заболеваний. Трехбуквенный вариант — это аббревиатура названия «полимеразная цепная реакция». Собственно, в этом названии и отражается суть метода, но для того, чтобы разобраться, придется основательно вспомнить школьный курс биологии.

Но сначала – немного истории. Метод ПЦР был разработан в 1983 году Кэри Мюллисом, за что он был удостоен Нобелевской премии. Изначально метод использовался в основном для научных целей, но затем, разглядев его перспективность и эффективность, метод стали продвигать в практическую медицину.

В литературе очень часто встречается такое образное описание ПЦР: это метод, с помощью которого ученые могут находить иглу в стоге сена и затем строить стог из этих игл. В принципе, очень точное описание. Если продолжать сравнение, то игла – это небольшой участок генетического материала микроорганизма, а стог сена – это организм человека, в котором данный микроорганизм поселился.

ПРИНЦИП РАБОТЫ

За генетическую информацию в живом организме любого размера отвечает ДНК — двухспиральная дезоксирибонуклеиновая кислота, состоящая из последовательности четырех нуклеотидов, которые принято обозначать буквами А (аденин), Г (гуанин), Т (тимидин) и Ц (цитозин). Одно из основных правил генетики – правило комплементарности, то есть нуклеотиды соседних спиралей ДНК соединяются только в определеном порядке: А с Т, Г с Ц, и никак иначе.

У каждого живого создания (бактерия, вирус, рыба, зверь) – своя ДНК, причем для выявления конкретного организма достаточно иметь лишь небольшой участок этого хранилища генетической информации. Некоторые виды микроорганизмов, например, вирус иммунодефицита человека, хранят генетическую информацию в другой нуклеиновой кислоте – РНК, но и ее фрагменты можно находить с помощью ПЦР.

Именно на обнаружении этого небольшого, но уникального для каждого отдельного организма участка и построен принцип ПЦР. Для каждого возбудителя создан свой специфический генетический детектор, эталонный фрагмент ДНК, который по принципу комплементарности точно обнаруживает «свой» фрагмент ДНК и запускает реакцию создания огромного количества его копий.

Один цикл ПЦР длится около трех минут, количество копий растет в геометрической прогрессии. Таким образом, за несколько часов количество фрагментов увеличивается в несколько миллиардов раз. Понятно, что теперь определить, какой возбудитель у данной конкретной инфекции, достаточно легко.

ДОСТОИНСТВА

Теория – это, безусловно, замечательно, но что мы имеем на выходе? Какую практическую выгоду получает человек, когда отправляется на поиски вредоносных микроорганизмов, вооруженный ПЦР? Безусловно, одно из главных достоинств — это универсальность метода. ПЦР позволяет обнаруживать любые ДНК и РНК, даже когда бессильны другие методы. Оборудование, используемое для ПЦР, стандартно, оно не зависит от того, что именно и где именно мы ищем.

Следующий плюс — высокая специфичность. В материале, направленном на исследование, определяется уникальная последовательность нуклеотидов, характерная только для конкретного возбудителя. Таким образом, можно говорить, что специфичность метода достигает 100%. Кроме того, это позволяет одновременно, в одном и том же материале, проводить поиск нескольких возбудителей без какого-либо ущерба для качества ответа.

Метод ПЦР обладает высочайшей чувствительностью – мы уже говорили о том, что возможно найти всего один фрагмент генетического материала возбудителя.
Несомненное преимущество метода – оперативность. Постановка реакции занимает несколько часов, таким образом, вся диагностика, от момента сдачи материала на анализ до получения результата, отнимет всего один день.

При помощи ПЦР определяют возбудителя, а не реакцию на его внедрение со стороны организма. Таким образом, появилась возможность точно диагностировать заболевание еще в инкубационном периоде, когда нет никаких клинических или лабораторных признаков болезни.

НЕДОСТАТКИ

Безусловно, ПЦР не идеальный метод, имеются и свои недостатки. Но они напрямую связаны с его достоинствами и с так называемым «человеческим фактором». ПЦР – очень высокотехнологичный метод, требующий соблюдения строжайших правил оснащения лаборатории. Достаточно сказать, что в помещении должен быть установлен фильтр биологической очистки со степенью 99,9%. Это связано с тем, что в воздухе постоянно присутствует невероятный коктейль из фрагментов ДНК всевозможных живых организмов, и в процессе подготовки к проведению реакции образец может быть загрязнен — возможно «ложное срабатывание».

Оценивать результаты ПЦР должен практический врач, который лечит конкретного больного. Дело в том, что далеко не всегда положительный ответ ПЦР означает наличие заболевания. Например, человек пролечился от какого-либо заболевания, но погибший и уже не опасный возбудитель будет еще некоторое время «разбираться на запчасти» защитной системой организма. Если в этот момент сделать ПЦР – результат окажется положительным.

Другой вариант – это отрицательный результат ПЦР при наличии даже явной клинической картины. Одна из наиболее возможных причин – материал для исследования был взят «не оттуда». Образец должен брать квалифицированный врач, строго следуя инструкции, которую ему дает лаборатория.

КОГДА ЕГО НУЖНО ДЕЛАТЬ?

Когда следует бежать в лабораторию, чтобы проанализировать итоги вашего летнего отпуска? Специалисты советуют делать это в следующих случаях: выделения, зуд, чувство жжения в области половых органов, резко изменившийся запах от половых органов, дискомфорт при мочеиспускании, необычный характер выделений (цвет, количество, консистенция), случайный половой контакт без применения презерватива.

Безусловно, ПЦР — мощный и эффективный диагностический инструмент, позволяющий быстро и точно найти возбудителей очень многих инфекций. Чаще всего его используют для диагностики именно заболеваний, передающихся половым путем. Причем зачастую клиники и лаборатории уже предлагают своеобразные готовые «наборы» — 5 инфекций, 13 инфекций.

В любом случае нельзя ограничиваться только одним методом. Лучше всего комбинировать различные методы исследования – помимо определения самого возбудителя методом ПЦР необходимо оценивать и иммунный ответ организма, который определяется традиционными уже серологическими методами, например, ИФА.

И помните: положительный ответ любого, даже самого современного лабораторного исследования – это повод не для паники, а для визита к врачу.

ИСТОРИЯ ПЦР

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) была открыта в 1983 г. и американский “Science” назвал это открытие самым выдающимся открытием последних лет.

С быстротой молнии метод распространился по всему миру. ПЦР используется для проведения научных и практических исследований. Но прежде всего метод нашел широкое применение в области микробиологической диагностики.
Что такое полимеразная цепная реакция.

ПЦР – это метод, который позволяет найти в исследуемом клиническом материале небольшой участок генетической информации любого организма среди огромного количества других участков и многократно размножить его.

ПЦР (полимеразная цепная реакция) в настоящее время является наиболее совершенным диагностическим методом, позволяющим выявлять единичные клетки возбудители многих инфекционных заболеваний

ПРЕИМУЩЕСТВА МЕТОДА

• Специфичность метода равна 100%
• Высокая специфичность метода ПЦР обусловлена тем, что в исследуемом материале выявляется уникальный, характерный только для данного возбудителя фрагмент ДНК. Специфичность задается нуклеотидной последовательностью праймеров, что исключает возможность получения ложных результатов, в отличие от метода иммуноферментного анализа, где нередки ошибки в связи с перекрестно-реагирующими антигенами.
• Прямое определение наличия возбудителей
• Многие традиционные методы диагностики, например иммуноферментный анализ, выявляют белки-маркеры, являющиеся продуктами жизнедеятельности инфекционных агентов, что дает лишь опосредованное свидетельство наличия инфекции. Выявление специфического участка ДНК возбудителя методом ПЦР дает прямое указание на присутствие возбудителя инфекции.
• Высокая чувствительность
• Метод ПЦР позволяет выявлять даже единичные клетки бактерий или вирусов. ПЦР-диагностика обнаруживает наличие возбудителей инфекционных заболеваний в тех случаях, когда другими методами (иммунологическими, бактериологическими, микроскопическими) это сделать невозможно.
• Метод позволяет определять число копий возбудителя в пробе и тем самым контролировать виремию или бактеремию в процессе лечения.
• Универсальность процедуры выявления различных возбудителей
• Для ПЦР-анализа пригоден любой материал, в том числе и гистологические препараты. Материалом для исследования методом ПЦР служит ДНК возбудителя. Метод основан на выявлении фрагмента ДНК или РНК, являющегося специфичным для конкретного организма. Сходство химического состава всех нуклеиновых кислот позволяет применять унифицированные методы проведения лабораторных исследований. Это дает возможность диагностировать несколько возбудителей из одной биопробы. В качестве исследуемого материала могут использоваться различные биологические выделения (слизь, моча, мокрота), соскобы эпителиальных клеток, кровь, сыворотка.
• Возможность диагностики острых, вялотекущих и скрытых инфекций
• Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики трудно культивируемых, некультивируемых и скрыто существующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях.
• Применение ПЦР-диагностики также очень эффективно в отношении возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов. Методом ПЦР возможно выявление возбудителей не только в клиническом материале, полученном от больного, но и в материале, получаемом из объектов внешней среды (вода, почва и т.д.)
• Простота исполнения и возможность полной автоматизации.
• Высокоспецифичная, чувствительная и быстрая ДНК (ПЦР) диагностика многих заболеваний способствует не только их эффективному лечению, но и предотвращению распространения инфекции. Исследуемый материал может быть дезинфицирован химической или термической обработкой в момент его забора, и, следовательно исключается возможность инфицирования персонала в процессе проведения ПЦР.
• Высокая скорость получения результата анализа
• ля проведения ПЦР-анализа не требуется выделение и выращивание культуры возбудителя, что занимает большое количество времени. Унифицированный метод обработки биоматериала и детекции продуктов реакции, и автоматизация процесса амплификации дают возможность провести полный анализ в течение краткого времени
• Результаты получают через несколько часов, то есть в течение одного рабочего дня

НАИБОЛЕЕ ЭФФЕКТИВНО И ОБОСНОВАННО ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА

• в урологической и гинекологической практике – для выявления хламидиоза, уреаплазмоза, гонореи, герпеса, гарднереллеза, микоплазменной инфекции, ВПЧ – вирусов папилломы человека
• в пульмонологии – для дифференциальной диагностики вирусных и бактериальных пневмоний, туберкулеза
• в гастроэнтерологии – для выявления геликобактериоза
• в клинике инфекционных заболеваний – в качестве экспресс-метода диагностики сальмонеллеза, дифтерии, вирусных гепатитов В, С и G
• в гематологии – для выявления цитомегаловирусной инфекции, онковирусов

ЗАБОР КЛИНИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА

Исследуемым материалом для ПЦР могут служить соскобы эпителиальных клеток, кровь, плазма, сыворотка, плевральная и спинномозговая жидкости, моча, мокрота, слизь и другие биологические выделения, биоптаты.

Забор материала производится в условиях процедурного кабинета соответствующего профиля. После забора пробы как можно скорее должны быть доставлены в ПЦР-диагностическую лабораторию.

Забор образцов необходимо производить при помощи стерильного, желательно одноразового, инструментария только в одноразовые стерильные пластиковые пробирки или в стеклянные пробирки, предварительно обработанные в течение часа хромовой смесью, тщательно промытые дистиллированной водой и прокаленные в сушильном шкафу при температуре 150 оС в течение 1 часа.

1. Эпителиальные соскобы со слизистых оболочек
   Обычно используются для диагностики заболеваний, передающихся половым путем, таких как гонорея, хламидиоз, микоплазмоз, уреаплазмоз, трихомониаз, гарднереллез, герпетическая и другие инфекции, поражающие слизистые оболочки. Забор материала лучше всего осуществлять с помощью специальных одноразовых стерильных зондов типа Сervex brush или Voba-brush, имеющих вид ершика и обеспечивающих получение большого количества клеточного материала с исследуемого участка. В случае забора материала из уретры обследуемый не должен мочиться в течение последних 1,5-2 часов.
   из уретры у мужчин – ершик осторожно вводят на глубину 4 см и совершают 1-2 вращательных движения, после чего ершик извлекают;
   из уретры у женщин – ершик осторожно вводят на глубину 1 см и совершают 1-2 вращательных движения, после чего ершик извлекают;
   из цервикального канала – предварительно удаляют слизь с помощью стерильного ватного тампона, затем вводят ершик на глубину 0,5-1 см, совершают 1-2 вращательных движения, после чего ершик извлекают;
   со слизистой зева и дыхательных путей – слегка вращая ершик, проводят им 1-2 раза по слизистой в местах предполагаемой локализации инфекционного агента;
   из конъюнктивы – оттянув край века, кончиком ершика осторожно проводят по слизистой в местах предполагаемой локализации инфекционного агента.
   Внимание! При заборе материала недопустимо попадание следов крови и большого количества слизи!
   После забора материала зонд опускают в пластиковую пробирку, содержащую 100 мкл стерильного физиологического раствора, тщательно перемешивают, остатки жидкости на зонде отжимают о стенки пробирки, зонд извлекают (выбрасывают в контейнер с дезинфицирующим раствором), а приготовленную таким образом пробу передают в лабораторию.
   
2. Моча
   Моча может использоваться при инфекционном поражении мочеполового тракта у мужчин и мочевыделительных органов у женщин (у мужчин использование в качестве материала мочи заменяет эпителиальный соскоб).
   Первые 50 мл утренней мочи собирают в чистый, стерильный флакон с плотной крышкой.
3. Мокрота
   Мокрота используется для диагностики туберкулеза и реже для диагностики респираторных форм хламидиоза и микоплазмоза. Мокроту в количестве 15-20 мл собирают в стерильный (одноразовый) флакон.
4. Кровь, плазма, сыворотка
   Используются для ПЦР-анализа вирусов гепатитов B, C, D, G, герпеса, ЦМВ, ВИЧ, исследования генов человека.
   Венозная кровь в количестве 1-1,5 мл отбирается в стерильную пробирку с раствором цитрата натрия (желательно натощак). Хранить при температуре 4оС не более 24 часов (не замораживать!). В случае необходимости длительного хранения (только для гепатитов) необходимо отобрать 1 мл сыворотки или плазмы крови и хранить ее при температуре -16-20 оС не более 2 недель.
5. Биологические жидкости
   Сок простаты, плевральная, спинномозговая, околоплодная, суставная жидкость, бронхоальвеолярный лаваж, слюна забираются по показаниям стандартным способом с использованием стерильного (одноразового) инструментария в количестве 0,1- 1,0 мл в стерильные разовые пробирки с плотно закрывающимися крышками.
6. Биоптаты
   Чаще всего используют биоптаты желудка и двенадцатиперстной кишки для выявления хеликобактерной инфекции. Биопсийный материал объемом 2-3 мм3 помещают в стерильную (одноразовую) пробирку с плотной крышкой.

ХРАНЕНИЕ И ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ ОБРАЗЦОВ

Образцы могут находиться при комнатной температуре не более 2-х часов. При необходимости более длительного хранения пробы могут быть помещены в холодильник с температурой 2-8оС на срок не более суток. Более продолжительное хранение (до 2-х недель) допустимо в замороженном виде в морозильной камере при температуре минус 20оС. Не допускается повторное замораживание-оттаивание проб.

Если ПЦР-диагностическая лаборатория и процедурный кабинет для забора проб территориально разобщены, то транспортировка проб должна осуществляться в термосах или термоконтейнерах с соблюдением правил хранения образцов и правил транспортировки инфекционных материалов.

ПРИМЕНЕНИЕ ПЦР В ПРАКТИЧЕСКОМ ЗДРАВООХРАНЕНИИ

Использование метода ПЦР для диагностики инфекционных заболеваний как бактериальной, так и вирусной природы имеет колоссальное значение для решения многих проблем микробиологии и эпидемиологии. Применение этого метода также способствует развитию фундаментальных исследований в области изучения хронических и малоизученных инфекционных заболеваний. Однако следует отметить, что метод ПЦР лишь дополняет спектр традиционных методов, используемых в микробиологической диагностике. Наиболее рационально и эффективно применение ПЦР для обнаружения микроорганизмов трудно культивируемых в лабораторных условиях, атипичных форм бактерий. К ним также относятся внутриклеточные паразиты и микроорганизмы, способные длительно персистировать в организме хозяина. В таблице 2 приведены основные показания к применению метода ПЦР при различных заболеваниях.